暗场光学切片技术能否破解荧光显微成像的背景干扰困局？

  在生物医学领域，荧光显微成像如同科学家窥探生命奥秘的“眼睛”，其分辨率与清晰度直接决定了我们对微观世界的认知深度。然而，当光线穿透生物组织时，散射效应形成的离焦背景如同笼罩在图像上的“迷雾”，不仅模糊了精细结构，更成为限制深层组织成像的关键难题。近期，北京大学席鹏教授与深圳大学屈军乐教授团队在《Nature Methods》发表的“Dark-based optical sectioning assists background removal in fluorescence microscopy”研究，以计算机视觉与光学成像的跨界融合，为这一困境提供了革命性解决方案。

 传统光学层切技术的困境与突破契机

传统荧光显微成像为对抗背景干扰，发展出共聚焦、多光子、光片荧光等光学层切技术。这些方法通过调控光路抑制离焦信号，却面临硬件系统复杂昂贵、高速成像时标受限、强光激发导致光毒性等挑战。即便采用组织透明化等生物学手段，也因样本制备繁琐、可能破坏组织结构而难以普及。更根本的矛盾在于：高散射深部组织中，现有技术无论怎样优化光路，都无法完全规避散射引发的背景干扰，导致图像对比度下降、定量分析失真。

研究团队从自然图像去雾技术中获得灵感——大气散射与荧光散射在图像频域表现出惊人的结构相似性，均呈现低频加性模糊特征。受此启发，他们提出“暗通道光学层切算法（Dark Sectioning）”，通过计算图像处理而非硬件改造，实现离焦背景的智能识别与抑制。这种“以软补硬”的思路，彻底打破了传统技术对高端光学元件的依赖。

 暗通道算法的技术内核与创新设计

Dark Sectioning的核心在于将自然图像“暗通道去雾”理论与荧光成像物理特性深度融合。其算法流程蕴含三大创新突破：

高低频智能分离策略：将原始图像分解为高频细节信号与低频背景成分，仅对低频部分进行背景估计，避免传统方法中弱荧光信号被误删的问题。例如在U2OS细胞微管成像中，该策略使纳米级结构细节保留率提升40%以上。

物理驱动的PSF建模：结合样本深度、成像参数等因素生成自适应点扩展函数，指导图像块划分与滤波窗口调整。在三维曲霉孢头成像实验中，此机制使轴向分辨率提升至共聚焦系统的86%，而数据采集速度提高3倍。

迭代背景抑制机制：通过多级低通滤波模拟离焦背景分布，支持单次快速处理与复杂场景下的多次迭代。在小鼠肾脏组织切片实验中，经3次迭代处理后，肌动蛋白丝图像的信背比（SBR）从4.3提升至9.1，超越传统HiLo成像技术。

与自然图像去雾不同，荧光图像的暗通道处理面临独特挑战：离焦背景的局部非均匀性（如不同深度组织的散射差异）、荧光信号的稀疏动态范围（生物分子表达的非线性特征）。为此，算法引入局部统计建模与非线性抑制函数，在小鼠脑部神经元成像中，成功将距表面650μm深处的神经元信噪比提升2.3倍，使原本淹没在背景中的细胞体清晰可辨。

 跨模态验证与多场景应用突破

研究团队通过系统的交叉实验，验证了Dark Sectioning在多种成像模式下的普适性：

宽场成像升级：仅用普通宽场图像，即可重建出接近共聚焦质量的结果。在COS-7细胞内质网成像中，处理后的图像结构保真度（RSP）达0.918，较原始宽场提升65%，误差率（RSE）降低82%。

超分辨成像增强：与结构光照明显微（SIM）结合时，有效抑制照明条纹伪影。在三维SIM重建中，线粒体成像的信背比提升37%，肌动蛋白丝的方向解析精度提高1.7°。

活体动态成像突破：在小鼠皮下血管实时观测中，克服组织散射导致的模糊，使直径10μm以下的微血管边缘锐利度提升50%，在15Hz高速采集下仍保持信号稳定性。

该技术在生物医学多个领域展现出变革性应用潜力：

深层神经科学：助力650μm深度神经元成像，结合深度学习分割模型，使神经元识别率提升38%，为阿尔茨海默病等神经退行性疾病研究提供高精度成像工具。

病理诊断革新：在200μm厚前列腺肿瘤组织成像中，将三维荧光图像转化为仿HE染色图像，细胞核边界清晰度提升60%，计数准确率达92%，为数字病理高通量评估奠定基础。

全脑光学成像：在透明化小鼠全脑组织中，抑制残留散射背景，神经纤维网络对比度提升45%，支持厘米级脑区的精细结构解析。

 计算成像新范式的未来图景

Dark Sectioning的诞生标志着荧光显微成像从“硬件主导”向“计算赋能”的范式转变。这种无需改造光学系统、仅通过算法升级即可提升成像质量的方案，为资源有限的实验室提供了高性价比解决方案。更重要的是，其与现有技术的兼容性展现出广阔拓展空间——可集成于光片、光场、受激发射损耗等高端成像系统，也能与深度学习超分辨率算法协同，形成“光学采集+计算增强”的闭环方案。

从技术演进角度看，该研究开辟了计算光学成像的新路径：通过挖掘图像内在统计特征与物理成像模型的结合点，实现对光学原理的计算重构。未来，随着算法在不同组织类型、成像模态中的进一步优化，Dark Sectioning有望成为连接传统显微技术与新兴智能成像的桥梁，推动生物医学成像在精度、深度与通量上的全面突破，为揭示生命复杂系统的动态奥秘提供更强大的技术支撑。